蛋白组学·2018文献阅读大赛 | 中枢神经系统和神经元细胞中tau蛋白的动力学研究

Original: 郭童精准医学与蛋白组学 2019-06-30

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参赛者：郭童老师，伦敦大学学院（University College London）

参赛作品：Neuron | 中枢神经系统和神经元细胞中tau蛋白的动力学研究

研究背景

Tau蛋白被认为在阿尔兹海默症以及多种神经退行性疾病的发病过程中的核心致病蛋白。在阿尔兹海默症中，脑脊液中的tau蛋白含量的上升与大脑内的神经病变相互关联，并且能够忠实的反映脑中神经纤维缠结病变的发展程度。但是在其他伴随神经凋亡和tau蛋白聚集的tau蛋白病（tauopathies）中，研究者们并没有发现这种关联。因此，最新的观点认为，CSF tau的增多也许并不直接与神经凋亡和神经纤维缠结病变相关。在病理条件下，神经细胞代谢tau蛋白的路径和方式出现了异常，而脑脊液中tau蛋白的增多则是这种异常的结果和体现。

为了验证这一观点的正确性，研究者们必须首先弄清楚在正常条件下神经细胞中的tau蛋白是如何代谢/降解,以及被释放到神经细胞外的。在本文中，Sato等作者采用了先进的质谱技术，将免疫纯化，稳定同位素标记等技术结合起来，对大脑、脑脊液、诱导多能干细胞分化的神经元（iPSC-Derived Neurons）以及其培养基中的tau蛋白的种类和代谢动力学特征进行了全方位的分析，对于后续的生物标记物、诊断的研究提供了更加精确的数据。

文章同时也验证了使用稳定同位素标记在人体内研究神经系统蛋白的可行性，并且提供了初步的技术数据，为接下来的研究奠定了基础。

文献速读

1. 神经系统中的tau蛋白谱系（profile）

作者首先使用了质谱结合免疫纯化的方法,测定了各生物样本中tau蛋白同源异构体和tau蛋白片端的含量。为了能够较为全面的分析tau蛋白在大脑以及脑脊液中的存在形式以及片段化情况，作者在免疫纯化阶段使用了8个识别tau蛋白不同区域的抗体 (Figure 1A), 以得到能够覆盖tau蛋白全部序列的肽链。

在大脑中,作者一共检测到了20个tau蛋白的肽链 (Figure1B). 这些肽链有的对应不同的同源异构体所共有的蛋白序列（common region）, 而有些肽链则对应不同的同源异构体.相比于共有序列, 2N结构域对应的肽链 (68到87号残基和88到126号残基)的含量极低 (仅占共有序列含量的5.3%), 说明2N结构域在大脑中的表达量很低，或者经过了其他翻译后修饰而无法被检测到。大部分的tau蛋白都以未被切割的全长形式存在 (76.0%±8.4%)，而其余(24.0%±8.4%)的 tau 蛋白则缺少了C-端的结构域,说明这一部分tau蛋白受到了切割.

与大脑中tau蛋白形成对比的是，在脑脊液中,绝大部分tau蛋白都是以tau蛋白片段的形式存在的。质谱分析几乎无法检测到含有第268号残基以后的tau蛋白肽链，说明这些tau蛋白片段都缺失了微管结合结构域以及其后面的C-端序列 (Figure 1C) 。使用Tau5抗体富集到的肽链要明显小于使用其他识别更靠近N-端的tau蛋白序列的抗体,这说明对tau蛋白的切割是发生在Tau5抗体的抗原表位的(残基210-230)。

Figure 1. Tau profile in the human CNS and Neurons

为了测试由诱导多能干细胞分化产生的神经元是否能够忠实的反映出大脑以及脑脊液中tau蛋白的表达和切割状态，作者进一步分析了通过对细胞匀浆以及培养基中各种tau蛋白种类的含量，来绘制tau蛋白在细胞内以及细胞外的存在状况。

作者发现在6周大的诱导神经元细胞中, 胞内的tau蛋白的谱系与大脑中的tau蛋白谱系总体上十分接近，大部分的tau蛋白都以全长的形式存在。而2N结构域的含量则大幅低于共有序列的含量. 值得注意的区别是4R tau异构体的含量要比共有序列的含量小了2个数量级（Figure 1D）。这一结果与之前的发现吻合：之前的研究成果表明在诱导神经元中，3R tau蛋白异构体的表达占据主导地位。与之前在脑脊液样品中得到的结果相似的是，在神经元细胞培养基中，含有微观蛋白结构域和C端tau蛋白序列的肽链含量相比细胞内有显著下降（Figure 1E）。与脑脊液中tau蛋白谱系不同的是，在培养基中含有少量的全长tau蛋白，这部分全长tau蛋白可能是由正常死亡的神经元细胞释放的。

综上所属，由诱导多能干细胞分化产生的神经元拥有着与人体样本相似的tau蛋白切割谱系，进一步证明了其作为疾病研究模型的潜力。

2. 诱导多能干细胞分化的神经元中的tau蛋白的动力学特征

为了进一步研究不同tau蛋白片段的代谢特征，作者使用了稳定同位素标记动力学（stable isotope labelling kinetics，SILK）方法，来监控不同环境下tau蛋白的生产和降解速率。通过之前对tau蛋白肽链的分析，作者发现含有亮氨酸的tau蛋白肽链拥有这最高的丰度值，并且被所有的tau蛋白的同源异构体所共有。因此，作者决定使用碳13同位素所标记的亮氨酸（¹³C₆-leucine）作为稳定同位素的载体。¹³C₆-leucine能够整合到新合成的蛋白中，在配合使用tau蛋白的特异性抗体，作者就能够监控tau蛋白从新生到降解的全过程。

在验证了这种方法的灵敏度，有效性以及使用条件之后，作者首先使用SILK 方法研究了诱导神经元中tau蛋白的动力学特征。诱导神经元在含有105 mg/L的¹³C₆-leucine的培养基中培养2周时间后再在不含有同位素标记的环境下进一步培养3周 (Figure 2A) 。

Figure 2. Differential Tau Kinetics of Tau Isoforms in iPSC-Derived Neurons

在后续的质谱分析中，作者一共获得了16个胞内tau蛋白肽链和14个胞外tau蛋白肽链的动力学曲线。总体来说，tau蛋白的整个生产-降解周期在21天左右。位于微管结合区域之前的tau蛋白肽链无论是在胞内还是在胞外都有着相似的半衰期。新合成的tau蛋白肽链出现3天后，相应的信号才开始出现在细胞培养基中，含有N-端结构域的tau蛋白片段是通过主动分泌的方式随着时间的增加而被释放到胞外的（Figure 2B）。

值得注意的是，含有C-端tau蛋白序列的肽链几乎在合成后立即被释放到细胞外，这说明全长的tau蛋白是通过不同的机制被释放到细胞外的。同时，无论是在细胞内还是在细胞外,全长tau蛋白的降解速率都要高于片段化的tau蛋白。不同的tau蛋白片段也有不同的动力学特征。在细胞外，对应tau蛋白的中部区域，微管集合区域和C-端的肽链的半衰期依次减少，这说明含有这些tau蛋白序列的片段在分泌过程中经受了不同的蛋白酶切割过程 (Table 1)。

Table 1. Summary of Tau Peptides and Half-Lives in the iPSC-Derived Neurons

同时,4R tau蛋白异构体的半衰期要短于3R tau 蛋白: 4R tau蛋白所独有的两个肽链的半衰期要明显小于3R tau所特有的肽链的半衰期。另外，磷酸化也会影响tau蛋白的半衰期。在第217号残基和212/214号残基被磷酸化的tau蛋白肽链相比未被磷酸化的对照组肽链其平均半衰期缩短了约1.7天。

3.人体中的tau蛋白动力学曲线

为了测定人体中tau蛋白的周转率（turnover），作者设计了口服和输液两种方法将¹³C₆-leucine标记导入到受试者体内，并且在不同的时间点对CSF进行取样 (Figure 3A-E)。在十天的口服之后，¹³C₆-leucine的标记利用率为2%-3%，而使用输液的方法后¹³C₆-leucine标记的利用率到达了30%-40% （Figure 3C，F）。

作者应用房室分析法（compartmental model）对6个受试者的脑脊液样本以及一个受试者的大脑样本中的tau蛋白的周转分速度和半衰期进行了测定和计算，结果得出tau蛋白在脑脊液中的代谢分速度为 0.00323±0.0091池/天，相对应的，tau蛋白的半衰期为23±6.4 天（Figure 3D，H）。大脑中的tau蛋白则呈现出与脑脊液中的tau蛋白相似的动力学曲线（Figure 3G）。

Figure 3. Tau Kinetics in the Human CNS

总结

在本文中，作者首先使用免疫纯化联合质谱的方法对大脑，脑脊液，诱导干细胞分化的神经元以及其培养基中的tau蛋白谱系进行了绘制。利用质谱技术作者不但验证前人的研究成果，而且提供了精确定量的数据，并且证明了诱导神经元细胞能够基本反映出大脑中tau蛋白的谱系。更为重要的是，作者通过使用稳定同位素标记动力学的方法对于不同种类的样本中的tau蛋白的代谢动力学特征进行了测定，并且指出tau蛋白的同源异构体，片段化和磷酸化都会影响tau蛋白的降解速率。

在本文中作者更尝试使用输液的方法将同位素标记引入受试者体内，并且证明了这种方式相对于口服有着效率高，身体负担小，反应灵敏等特点，这对未来该方法在人体内的应用奠定了基础。

有意思的是，在健康条件下，更容易发生聚集的tau蛋白种类（tau protein species）拥有更高的清除速率，而这种代谢机制的故障则很可能在tau蛋白的堆积和病理改变中扮演重要的作用。